分子生物學實驗講義示例

CTAB法提取植物基因組DNA

【實驗背景】

高等動物，高等植物的基因組相當龐大，一些物種的特定基因組包括了該物種生長，發育，繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息量，因而對真核細胞基因組的結構，組成，以及表達調控的研究是至關重要的，而提取要求是獲得純度高和收得率高。

【實驗目的】

1、掌握植物材料基因組DNA的CTAB法提取分離基本原理的方法；

2、掌握微量移液槍、液氮研磨、微量試管、高速離心機等使用操作技術。

【實驗原理】

植物組織採用液氮研磨達到細胞破碎，細胞內容物採用CTAB分離蛋白質、多糖，再有苯酚、氯仿、異戊醇混合液萃取純化，RNA由RNA酶消化，分離出的DNA由無水乙醇沉澱分離

【材料儀器】

材料：幼嫩的植物材料1.0g左右（紅葉石楠）

儀器：移液槍、電子天平、恆溫水浴箱、高速離心機、EP管、液氮、研磨等。

【實驗試劑】

抽提緩衝液（2×CTAB溶液）：2％CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、20mmol/LEDTA、1.4mol/L NaCL、1％β-巰基乙醇、

0.1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、100mmol/L Tris-HCl（pH=8.0） TE: 10Mm Tris-HCl（pH=8.0），1mM EDTA

其他試劑：液氮、RNA酶、氯仿、異戊醇、CTAB、無水乙醇、苯酚、EDTA等

【實驗操作】

取1.0g植物材料，雙蒸水洗淨，並用濾紙吸乾 植物材料剪成0.5cm左右碎片，放入預冷的瓷研磨中。 加入液氮速冷，研磨成細粉（越細越好）。

轉入加有抽提緩衝液3.0ml的5ml離心管

60℃水浴保溫1小時（不時轉動試管）

分裝成2個管，15,000 rpm，離心10分鐘

取上清轉入另一個新的離心管，加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），混合均勻抽提至水乳膠融狀。

15,000 rpm離心5分鐘

上清液轉移到另一離心管中，加入0.8-1.0倍體積預冷異戊醇 ，-20℃保溫30分鐘－1小時，緩緩混勻DNA成絮狀折出

15,000 rpm，離心5分鐘，棄上清

DNA沉澱用冰冷的70％乙醇洗2次

揮發盡乙醇後，用200μl TE緩衝液溶解DNA，-20℃凍存。

【注意事項】

1、使用新鮮、幼嫩的'材料，材料應適量。

2、如果樣品容易呈粘稠狀，可能含有較多的多糖。

3、如果樣品溶液呈棕色，可能含有較多的酚類物質。

4、操作過程中避免劇烈振盪，器件、器皿和試劑需要高溫滅菌。

【思考題】

1、爲什麼要用新鮮、幼嫩的植物組織材料？

2、爲什麼在操作過程中避免劇烈振盪？

3、爲什麼器件、器皿和試劑需要高溫滅菌？

4、如何提高提取植物組織DNA的產量？

苯酚：作爲蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由於蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶於酚相，而DNA溶於水相。

氯仿：也可使蛋白質變性並加速有機相與液相分層。

異戊醇：有助於消除抽提過程中產生的氣泡。

CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉澱核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質和多聚糖形成複合物，只是不能沉澱核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質後加入乙醇沉澱即可使核酸分離出來