實驗微生物接種技術講解

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微生物接種篇一：實驗微生物接種技術

一、目的：

學習微生物工作的基本接種方法，建立純培養技術中的“無菌”概念，掌握無菌操作技術。

二、原理：

所謂接種就是將一定量的純種微生物在無菌操作條件下轉移到另一已滅菌，並適宜於該菌生長繁殖所需的培養基上的過程。本實驗要求嚴格進行無菌操作，一般是在無菌操作檯或在實驗室內火焰旁進行。根據不同的實驗目的和培養方式，可以採用不同的接種工具和接種方法。

三、實驗材料：

斜面培養基、液體培養基、平板培養基、記號筆、酒精燈、接種針、消毒酒精、塗布棒等。

四、操作步驟

（一）無菌操作

菌種分離或移接工作應在無菌環境中進行，接種室、接種箱或超淨工作臺是常用的接種環境。用前先清潔好衛生，再進行消毒處理。可用紫外線燈和甲醛燻蒸的雙重作用，或用3%來蘇爾及其他表面消毒進行噴霧。

操作者的手應先用肥皂洗淨，再用酒精棉球消毒；整個操作過程都要靠近酒精燈火焰；接種工具在用前和用後必須在燈焰上滅菌；棉塞不得亂放，操作中只能夾在手上；不能有跑、跳等力度大的動作，以免引起空氣大振動而增加染菌機會。

（二）接種方法

（1）斜面接種：

從已長好微生物的菌種管移接到另一斜面管的方法。此法用於好氣性微生物的接種。

左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，並儘量放平。用右手先將棉塞擰轉鬆動，再拿接種環，用右手的小指、無名指和手掌撥下棉塞並夾緊，同時將管口在火焰上燃燒一圈，接種環灼燒滅菌後插入管內，冷卻、挑菌，立即轉入斜面管底部，沿斜面劃曲線或直線。

圖1.斜面接種示意圖

（2）液體接種：

由斜面菌接種到液體培養基（如試管或三角瓶等）中的方法。

操作與上法基本一致，只是在將接種環送入液體培養基中時使環在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，然後塞上棉塞，再輕輕搖動均勻，即可培養。如果菌種是培養在液體培養基中時，一般用移液管或滴管接種。

（3）穿刺接種：

用接種針挑取菌種後，插入深層固體培養基內，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用於厭氣性細菌接種、檢查細菌的運動能力。

（4）平板接種：

將菌種接至培養皿的方法，平板接種的目的是觀察菌落形態、分離純化菌種，活菌計數以及在平板上進行各種試驗時採用的一種接種方法，可分爲下面幾種：

1)斜面接平板

a.劃線法：見平板劃線分離法。

b.點種法：一般用於觀察黴菌和酵母細胞，輕輕點在平板的表面（根黴點一點，麴黴、酵母可點3-4點）即可。

2)平板接斜面：一般是將經平板分散培養得到的單菌落接種到斜面，以便作鑑定或擴大培養、保存之用。

五、思考題

1．何謂無菌操作？接種前應作哪些準備工作？

2．總結幾種接種方法的要點及應注意的事項？

微生物接種篇二：微生物的接種、分離純化與培養方法

實驗目的：學習掌握無菌操作技術；學習接種方法；學習常用的分離、純化菌種的方法。實驗內容：

一、接種

將微生物接到適於它生長繁殖的人工培養基上或活的生物體內的過程叫做接種。１、接種工具和方法

在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環、接種針。由於接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作爲接種工具進行液體接種。在固體培養基表面要將菌液均勻塗布時，需要用到塗布棒。（圖３－３）

圖３－３接種和分離工具

1．接種針2.接種環3.接種鉤4.5.玻璃塗棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

常用的接種方法有以下幾種：

１）劃線接種這是最常用的接種方法。即在固體培養基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。２）三點接種在研究黴菌形態時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落後，來觀察、研究它們的形態。除三點外，也有一點或多點進行接種的。

３）穿刺接種在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常採用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養基一般是半固體培養基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。

４）澆混接種該法是將待接的微生物先放入培養皿中，然後再倒入冷卻至45°

C左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之後，置合適溫度下培養，就可長出單個的微生物菌落。

５）塗布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然後再將菌液倒入平板上面，迅速用塗布棒在表面作來回左右的塗布，讓菌液均勻分佈，就可長出單個的微生物的菌落。

６）液體接種從固體培養基中將菌洗下，倒入液體培養基中，或者從液體培養物中，用移液管將菌液接至液體培養基中，或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中，都可稱爲液體接種。

７）注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉接至活的生物體內，如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。８）活體接種活體接種是專門用於培養病毒或其它病原微生物的一種方法，因爲病毒必須接種於活的生物體內才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料餵養。

２、無菌操作

培養基經高壓滅菌後，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）於培養基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。

實驗檯面不論是什麼材料，一律要求光滑、水平。光滑是便於用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養基時利於培養皿內平板的厚度保持一致。在實驗臺上方，空氣流動應緩慢，雜菌應儘量減少，其周圍雜菌也應越少越好。爲此，必須清掃室內，關閉實驗室的門窗，並用消毒劑進行空氣消毒處理，儘可能地減少雜菌的數量。

空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨着灰塵落下，所以接種時，打開培養皿的時間應儘量短。用於接種的器具必須經乾熱或火焰等滅菌。接種環的火焰滅菌方法：通常接種環在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養基，待接種環冷卻到室溫後，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養基上。（圖３－４）然後，將接種環從柄部至環端逐漸通過火焰滅菌，復原。不要直接燒環，以免殘留在接種環上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養皿的蓋打開一小部分進行接種。在向培養皿內倒培養基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。

二、分離純化

含有一種以上的微生物培養物稱爲混和培養物（Mixedculture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自於一個親代細胞，那麼這個菌落稱爲純培養（Pureculture）。在進行菌種鑑定時，所用的微生物一般均要求爲純的培養物。得到純培養的過程稱爲分離純化，方法有許多種。１、傾注平板法

首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養瓊脂培養基充分混合，然後把這混合液傾注到無菌的培養皿中，待凝固之後，把這平板倒置在恆箱中培養。單一細胞經過多次增殖後形成一個菌落，取單個菌落製成懸液，重複上述步驟數次，便可得到純培養物。（圖３－５，a）

圖３－５傾注平板法（a）塗布平板法（b）圖解1.菌懸液2.熔化的培養基3.培養物4.無菌水

圖３－５傾注平板法（a）塗布平板法（b）圖解1.菌懸液2.熔化的培養基3.培養物4.無菌水

２、塗布平板法

首先把微生物懸液通過適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然後用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地塗布在培養基表面上，經恆溫培養便可以得到單個菌落。（圖３－５，b）３、平板劃線法

最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖３－６）當接種環在培養基表面上往後移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，最後在所劃的線上分散着單個細胞，經培養，每一個細胞長成一個菌落。（圖３－７）

４、富集培養法

富集培養法的方法和原理非常簡單。我們可以創造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重複移種，最後富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞羣體中，使其大量生長。通過多次重複移種便可以得到純的寄生菌。

５、厭氧法

在實驗室中，爲了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養基的試管作爲培養容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數分鐘，以便逐出培養基中的溶解氧。然後快速冷卻，並進行接種。接種後，加入無菌的石蠟於培養基表面，使培養基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種後，利用N2或CO2取代培養基中的氣體，然後在火焰上把試管口密封。有時爲了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種於培養基上，然後再把培養皿放在完全密封的厭氧培養裝置中。

三、培養

微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類不同，培養的方式和條件也不盡相同。

１、影響微生物生長的因素

微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。

1)營養物濃度

細菌的生長率與營養物的濃度有關:μ=μmax*C/(K+C)營養物濃度與生長率的關係曲線是典型的雙曲線。

K值是細菌生長的很基本的特性常數。它的數值很小，表明細菌所需要的營養濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長。然而營養太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這是因爲除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱爲維持能。另一方面，隨着營養物濃度的增加，生長率愈接近最大值。

２）溫度

在一定的溫度範圍內，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點內，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處於最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至會死亡。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點是恆定的。但也常受其它環境條件的影響而發生變化。根據微生物最適生長溫度的不同，可將它們分爲三個類型：a.嗜冷微生物：其是適生長溫度多數在-10℃－20℃之間b.中溫微生物：其最適生長溫度一般在20℃－45℃之間c.嗜熱微生物：生長溫度在45℃以上。

３）水分

水分是微生物進行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長髮育的水分活性範圍內，均具有狹小的適當的水分活性區域。

４）氧氣

按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分爲以下五個類型。a.需氧微生物

這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大於大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數微生物都屬於這個類型。b.兼性需氧微生物

這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長，只不過所進行的代謝途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下，它進行發酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發酵。c.微量需氧微生物

這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。d.耐氧微生物

這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會被氧氣所殺死。c.厭氧微生物

這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生長產生毒害，不是被抑制，就是被殺死。

２、培養方法

1）根據培養時是否需要氧氣，可分爲好氧培養和厭氧培養兩大類。

好氧培養：也稱“好氣培養”。就是說這種微生物在培養時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養多數是通過搖牀振盪，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。

厭氧培養：也稱“厭氣培養”。這類微生物在培養時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養過程中，最重要的一點就是要除去培養基中的氧氣。一般可採用下列幾種方法：a.降低培養基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養基中，便可達到目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養基中，也可適合厭氧菌的生長。

b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養吸收氧氣；用植物組織如發芽的種子吸收氧氣；用產生氫氣與氧化合的方法除氧。

c.隔絕阻氧：深層液體培養；用石蠟油封存；半固體穿刺培養。

d.替代驅氧用二氧氣碳驅代氧氣；用氮氣驅代氧氣；用真空驅代氧氣；用氫氣驅代氧氣；用混和氣體驅代氧氣。

２）根據培養基的物理狀態，可分爲固體培養和液體培養兩大類。

固質培養：是將菌種接至疏鬆而富有營養的固體培養基中，在合適的條件下進行微生物培養的方法。

液體培養：在實驗中，通過液體培養可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。

微生物接種篇三：微生物接種技術

一、實驗原理

微生物接種就是在無菌條件下，用接種工具（針、環）從一支原菌種中挑取少許菌體，接入到另一支新的.培養基上擴大培養的技術。

要想得到大量的菌種，適應生產、科研和教學要求，就要進行微生物的接種，擴大菌種數量。接種因使用不同容器、不同的培養基，達到不同的目的，而有不同的接種方法，但它們的基本要求是相同的。通常接種都應在空氣經過消毒滅菌的接種室或接種箱或超淨工作臺內完成。

二、實驗步驟

1.斜面接種

（1）左手夾住試管（2）灼燒接種環

（3）拔出棉塞，夾在小指、無名指上，管口過火

（4）取菌、接種，接種後在火焰上方迅速塞好棉塞

（5）寫好標籤（菌種名、日期、接種者姓名），貼於斜面正上方前端約1cm處.

（6）於37度培養箱中培養24小時。（全班統一裝入一保鮮袋）

（7）一星期後觀察分離效果，拍照，分析結果

2.平板培養基（平板）製備

（1）將滅過菌的培養皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

（2）右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰。

（3）用左手的拇指和食指將培養皿打開一條稍大於瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養基（約10到20ml）倒入培養皿，左手立即蓋上培養皿的皿蓋。

（4）等待平板冷卻凝固。

3.塗布平板法（以小組爲單位，對混合菌菌懸液進行塗布分離）

(1)用75%酒精或0.01%新潔而滅擦洗雙手,進行消毒處理。

（2）將塗布器浸在盛有酒精的燒杯中。

(3)取少量菌液滴加到培養基表面。

（4）將沾有少量酒精的塗布器在火焰上引燃，待酒精燃盡後，冷卻8~10s。

（5）用塗布器將菌液均勻地塗布在培養基表面，塗布時可轉動培養皿，使菌液分佈均勻。

（6）將接種好的平板在皿底做好標記。

（7）塗布分離的平板全班一起放入保鮮袋中，37度培養箱中倒置培養24h。

（8）一星期後以小組爲單位觀察分離效果，拍照，分析結果4.劃線分離：從污染平板中純化細菌菌落（每人1個平板）

(1)用75%酒精或0.01%新潔而滅擦洗雙手,進行消毒處理。

（2）將滅過菌的培養皿放在火焰旁的桌面上，右手拿接種環，在火焰上灼燒，待冷卻後用接種環在長有混合菌落的平板上挑取少量菌種，用左手的拇指和食指將培養皿打開一條縫隙，劃線，其他每區劃線之前一定要把殘餘的菌體燒掉；待接種環完全能卻後通過前1區劃線。（一般劃4個區）

(3)將接種好的平板在皿底做好標記。

（4）劃線分離的平板全班一起放入保鮮袋中，37度培養箱中倒置培養48h.

（5）一星期後觀察分離效果，拍照，分析結果

三、實驗結果

1、斜面接種

實驗結果及分析：此次斜面接種無污染，菌體生長較旺盛，形成了較多的單菌落，分離效果較好，這與接種場所進行了嚴格的消毒處理以及接種操作在超淨工作臺上進行，接種前用75%酒精對雙手進行了消毒處理，接種工具、管、瓶口接種前後要通過灼燒滅菌，塞子不能脫手等因素都有關，有效地防止了雜菌的污染。菌體的生長情況跟培養溫度、溼度、pH都有關。但接種時沒有使接種面積達到最大，以至於沒有最充分地利用培養基，菌體沒有長滿培養基，還有接種時不小心劃破了培養基的表面，下次做斜面接種時要注意儘可能地使接種面積達到最大，最充分地利用培養基，還有就是要避免劃破培養基，力求做到操作規範、科學、準確。

2.塗布平板法

上圖爲稀釋100倍的塗布平板法結果

上圖爲稀釋1000倍的塗布平板法結果

上圖爲稀釋10，000倍的塗布平板法結果

上圖爲稀釋100，000倍的塗布平板法結果

實驗結果與分析：如上4幅圖所示，此次所用菌液中包含兩種菌，即大腸桿菌和蘇雲金芽孢桿菌，其中菌落較大、數量較多的爲蘇雲金芽孢桿菌，而菌落較小、數量較少的爲大腸桿菌，說明混合菌液中蘇雲金芽孢桿菌的濃度較大。經稀釋100倍的菌液所生長起來的菌落數量最多，單菌落數量也挺多，但所佔的比例不大，特別是蘇雲金芽孢桿菌大多數都連在了一起，分離效果不好。經稀釋1000倍的菌液所生長起來的菌落數量較多，可以看到蘇雲金芽孢桿菌依然連成片，有些大腸桿菌菌落生長在蘇雲金芽孢桿菌菌落之上，就大腸桿菌而言，單菌落較多，分離效果較稀釋100倍的菌液好。經稀釋10，000倍的菌液所生長起來的菌落數量較少，依然有部分蘇雲金芽孢桿菌連成了片；大部分大腸桿菌菌落爲單菌落，分離效果較好。經稀釋10，000倍的菌液所生長起來的菌落數量最少，但蘇雲金芽孢桿菌依然連成了片；雖然大腸桿菌的單菌落較少，但分離效果是四個濃度中最好的。綜上所述，在一定濃度範圍內，稀釋倍數越大，分離效果越好。

3.平板劃線法