關於生物技術綜合實驗報告

篇一：四川大學-生物技術-綜合實驗報告-學生版

生物技術綜合實驗

甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表達

學生： 學號：

同實驗者：

<研究背景>

谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多種重要生理功能, 抗自由基和抗氧化應激作用, 保護細胞膜的完整性等。γ-GCS是植物細胞中GSH生物合成的限速酶, 可以調控GSH的生物合成量。GSH在生物體抵禦冷害、乾旱、重金屬、真菌等脅迫過程中起着重要作用, 說明γ-GCS也與植物抗逆過程密切相關。

實驗一 甘薯葉片RNA提取

一、實驗目的

1. 瞭解真核生物RNA提取的原理；

2. 掌握Trizol提取的方法和步驟。

二、實驗原理

Trizol 試劑是由苯酚和硫氰酸胍配製而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細胞、降解細胞其它成分的同時保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬於解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質並使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。在氯仿抽提、離心分離後，RNA處於水相中，將水相轉管後用異丙醇沉澱RNA。用這種方法得到的總 RNA中蛋白質和DNA污染很少。

三、實驗材料

1. 材料

甘薯（Ipomoea batatas Lam）葉片，品種爲徐薯18

2. 試劑

① 無RNA酶滅菌水：加入0.01%的DEPC，處理過夜後高壓滅菌；

② Trizol試劑；

③ 氯仿；

④ 異丙醇、75％乙醇；

⑤ TBE緩衝液；

⑥ 上樣緩衝液（6×）

3. 儀器

高壓滅菌鍋、微量移液器、臺式離心機、超淨工作臺、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統、1.5mL塑料離心管、槍頭和EP管架

四、實驗方法

1. 將葉片取出放入研鉢中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物葉片加入1 mL Trizol試劑，室溫放置5 min，使樣品充分裂解；

2. 每1 mL Trizol試劑加入200 μL氯仿，用手劇烈振盪混勻後室溫放置3-5 min使其自然分相；

3. 4℃ 12,000 rpm 離心15 min，吸取上層水相轉移到新管中；在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置15 min；

4. 4℃ 12,000 rpm 離心10 min，棄上清，RNA沉澱於管底；

5. RNA沉澱中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配製），溫和震盪離心管，懸浮沉澱； 4℃ 8,000 rpm離心2 min，棄上清；

6. 室溫放置10 min晾乾沉澱；

7. 沉澱中加入20μL RNase-free ddH2O，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；

8. 用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用EB染色並照相。

五、實驗結果

1. RNA提取結果

依照Trizol 試劑盒方法，提出的RNA較少，此部分未以圖或數據顯示。

2. RNA後電泳結果

如圖1. 其中9a爲本組實驗結果。由圖可知RNA條帶非常模糊，拖尾現象嚴重，幾乎無法分清具體條帶，亮度較大。點樣孔附近的紅色部分爲雜質，在提取過程中並未很好除去。

圖1. RNA提取跑膠結果。其中1泳道爲樣品Marker，9a泳道爲本小組RNA樣品。與標準對照可見條帶模糊，拖尾現象嚴重。

六、分析與討論

1. RNA的提取

產量並不多，可能是因裂解樣品不充分或RNA沉澱未完全溶解所致。在實驗過程中，由於對操作時間的掌握不熟練、操作技巧不完善，留上清與棄上清時令RNA損失了部分，使最終RNA產量不理想。

2. RNA電泳結果

有EB存在時，電泳後28S rRNA和18S rRNA在紫外燈下應看得很清楚，另出現條由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA組成的較模糊、遷移較快的帶。如果

RNA沒有降解，則28S rRNA的亮度應爲18S rRNA的2倍，且這兩條帶都無彌散現象發生。由圖1. 9a可知，RNA拖尾現象嚴重，說明RNA已大部分被降解；此外點樣孔附近出現紅色部分雜質，分析可能有並未除盡的蛋白質，同樣影響RNA電泳結果。

在進行實驗時，本小組成員未嚴格戴上口罩並勤換手套，這可能使外源

RNAase進入樣品，導致其降解嚴重。另外，提取出RNA後本小組未立即將樣品放入-70℃保存，也爲導致結果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分層的過程中，由於水相吸取過多，摻雜入部分蛋白質雜質而未於後續純化步驟除盡，RNA條帶拖尾嚴重可能還受該蛋白質影響。

七、總結：

本次試驗RNA提取非常失敗，從跑膠結果可見其降解嚴重。雖然大實驗無法避免試劑交叉污染的可能性，且電泳用膠的質量也會影響實驗結果，但從圖

1. 2a，3a，2b等條帶較爲清晰的小組實驗結果可知，瓊脂糖凝膠質量以及試劑對結果乾擾不大。那麼本小組成員在提取過程中的操作一定出現了很大失誤。首先口罩、手套應該嚴格按規定佩戴，提取過程對移液槍等儀器使用需謹慎仔細，儘量避免混入雜質。其次爲排除部分雜質影響可對RNA樣品用紫外線分光光度計測定吸光值檢驗，將有助於結果分析。最後，細節決定成敗，我們應汲取教訓避免接下來的實驗出現類似問題。

實驗二 第1鏈cDNA的合成和模板的驗證

一、實驗目的

1. 掌握第1鏈cDNA的合成方法和步驟

二、實驗原理

真核生物基因多爲斷裂基因，編碼區不連續，需經轉錄後加工才能成爲成熟mRNA。以真核成熟mRNA爲模板合成cDNA，進而獲得有連續氨基酸編碼的DNA序列，無需轉錄後加工，即可在原核細胞中表達。

真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：Oligo dT（12-18個T）。莫洛尼

氏鼠白血病毒逆轉錄酶（M-MLV ）以單鏈RNA爲模板，在引物的引發下合成與模板互補的DNA鏈（cDNA）。

mRNA 反轉錄生成的cDNA可作爲PCR的模板進行擴增稱爲RT-PCR，RT-PCR比Northern雜交更靈敏，對RNA的質量要求較低，操作簡便，它是在轉錄水平上檢測基因時空表達的常用方法。

三、實驗材料

1. 材料

徐薯18葉片RNA樣品

2. 試劑

① dNTP mixture（10 mM each）；

② Oligo (dT) Primer (10 μM)；

③ Total RNA；

④ RNase free ddH2O；

⑤ M-MLV 反轉錄酶；

⑥ 5×First-strand Buffer；

⑦ 0.1 M DTT；

⑧ Ribonuclease Inhibitor (40 U/μL)

3. 儀器

10μL 和100μL 的移液槍、0.5mL的EP管、PCR儀等

四、實驗方法

1. 在RNase free Microtube 管中配製下列混合液：

dNTP mixture（10 mM each）1 μL

*Oligo (dT) Primer (10 μM) 4 μL

Total RNA2 μL

篇二：生物技術綜合實驗報告(原生質體相關)

生物技術綜合實驗報告 （第一部分）

實驗一 工作液的配製、培養基配製、器皿洗滌及滅菌

一、實驗目的

掌握各種工作液配製方法；瞭解植物培養基的構成及配製方法；掌握高溫高壓滅菌的方法。

二、原理

培養基是植物組織培養的基本條件，同時也是關鍵因素。

溼熱條件(121℃的蒸汽，10分鐘)能夠有效地殺滅附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培養基中的微生物達到滅菌的目的。

三、器具和試劑

滅菌鍋，天平，電爐，微波爐，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，燒杯，pH試紙，培養皿，濾紙，Parafilm封口膜。

瓊脂，MS培養基大量元素，無菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT （激動素），1M NaOH及HCl，卡那黴素，頭孢黴素，乙酰丁香酮 。

四、 實驗內容

PH調節劑的配製、培養基母液的配製、培養基的配製、各種相關物品的準備

（一）培養基的配製步驟

1、取個乾淨燒杯，加入1/3-2/3左右的蒸餾水，用移液管取所需的母液加入燒杯。

2、稱取定量的蔗糖加入燒杯中並不斷攪拌，直到完全溶解，定容。

3、用NaOH或者 稀HCL調劑酸鹼值。

4、稱取定量瓊脂糖加入燒杯中，加熱煮沸攪拌，待瓊脂完全溶解，分裝。

5、高壓滅菌（121℃,15min-20min)。

6、冷卻，取出，備用。

（二）棉花無菌苗培養基的製備

1、取25 ml MS大量元素母液，稱取葡萄糖15g、於1升的燒杯中，定容後調pH值爲6.0，加入7.5g/l 瓊脂煮沸。

2、然後將其分裝到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。

3、用封口膜封口後在滅菌鍋中滅菌15分鐘。

4、滅菌後?於水平的工作臺上冷卻即可。

要求：配製 1L

（三）擬南芥無菌苗培養基的製備

1、擬南芥無菌苗培養基：1/2 MS大量元素+蔗糖10g/L，PH值6.0；加入7.5g瓊脂高溫高壓滅菌。

2、0.1%瓊脂糖：0.1g瓊脂糖/100ml 蒸餾水；無菌苗培養基和0.1%瓊脂糖均121°高壓滅菌15分鐘。

3、另準備20套9cm培養皿，滅菌。

要求：配製0.5L，裝1瓶滅菌，滅菌後培養基倒皿。

五、注意事項

1、爲了儘量減少人爲的誤差，必須嚴格按實驗步驟進行操作，嚴格按照要求的量來配製工作液、母液及培養基。

2、應當把培養基中的各種成分都寫在紙上，加進去一個以後即劃掉一個。

3、所有裝着培養基的試管、玻璃罐、玻璃瓶和培養皿等都應當清楚地做上標記。

4、每小組的操作的具體事項請參照黑板上貼的任務分組。

5、愛護實驗儀器及耗材，小心使用玻璃器皿，合理滅菌，因爲滅菌耗時較長。

實驗二 無菌苗的製備

一、原理

化學滅菌：0.1%昇汞(Hgcl2)溶液浸泡10分鐘可以對棉花種子等外植體進行滅菌，84消毒液（2%的次氯酸鈉）浸泡3分鐘可以對擬南芥等小種子外植體進行消毒。 物理消毒：紫外燈消毒、酒精燈火焰或高溫燒灼5min左右可有效殺死鑷子、剪刀等不鏽鋼操作器具的菌類達到消毒的目的。

二、實驗材料、器具和試劑

棉花品種YZ1;擬南芥col-0野生型 滅菌鍋，天平，電爐，三角瓶，封口膜，鑷子，酒精燈，剪刀，移液管，超淨工作臺。

0.1%昇汞溶液，84消毒液，75%酒精

三、實驗內容

（一）擬南芥無菌苗培養基倒皿

1. 取上次滅菌好的擬南芥培養基（500ml裝），稍微擰鬆瓶蓋，微波爐煮沸，邊煮邊搖動，至全部融化。

2. 將上次滅菌好的9cm培養皿分開放?超淨工作臺（超淨工作臺需先打開）上。

3. 將融化好的培養基分裝於培養皿中（500ml/18-20皿），將皿至於超淨臺上吹乾.。

（二）共培養培養基的配製

成分數量 成分 數量

MS大量元素 (20倍） 50 ml 2,4-D (0.1mg/ ml)1 ml

NH4NO3 (20倍) 50 ml 甘氨酸(1000倍)1 ml

微量元素 (100倍)10 ml KT(0.1mg/ml)1 ml

鐵鹽 (100倍) 10 ml 葡萄糖 30g/L

微生素(1000倍) 1 mlPH值5.85-5.90 肌醇 (100倍) 1 ml

依次加入上述物質，調PH值5.85-5.90，然後分裝至2個500ml藍蓋瓶，每瓶加入4g瓊脂，滅菌，滅菌後倒皿。

（三）選擇培養基的`配製

共培養培養基 +卡那黴素50mg/L + 頭孢黴素400 mg/L

滅菌後，待培養基涼至60度左右加入，混勻，倒皿。

（四）棉花無菌苗的製備

1、將棉籽用手術剪刀去殼（每人3顆，飽滿無病蟲害種子）。

2、用0.1%的昇汞滅菌13分鐘。

3、無菌水沖洗三遍，接種於無菌苗培養基中。

4、28℃條件下暗培養7天 （304培養箱）。

（五）擬南芥無菌苗的製備

大量法滅菌：將擬南芥種子放入1.5ml離心管中，加入84消毒液：無菌水=1:1的混合液1ml，上下搖晃滅菌2min，棄消毒液；加入1ml 75%的酒精混勻1min，然後無菌水清洗4次；加入0.1%瓊脂糖溶液懸浮種子，用移液槍塗布於擬南芥無菌苗培養基，

吹乾，封口。弱光培養兩天至種子萌發，轉至光照培養室培養兩週（304培養箱）。

五、注意事項

所有操作（除數種子）均在超淨工作臺上進行。

六、實驗結果

一週後觀察無菌苗的生長狀況

1、六瓶接種的棉花無菌苗中有一瓶被輕度污染，其餘五瓶生長狀況良好。2、擬南芥的無菌苗因塗布不均勻長勢一般，幼苗較其他小組要弱小，葉片顏色較深。

實驗三 愈傷組織的誘導及農桿菌介導的棉花遺傳轉化

一、實驗目的

掌握植物體細胞胚胎發生的基本理論；瞭解植物愈傷組織在誘導和分化過程中的形態學、細胞學特徵；進一步鞏固植物離體培養和無菌操作的步驟；掌握植物遺傳轉化的方法、理論；掌握根癌農桿菌介導的植物遺傳轉化技術。

二、實驗原理

植物細胞全能性：植物的每個細胞都包含着該物種的全部遺傳信息，從而具備發育成完整植株的遺傳能力。

愈傷組織：

胚性愈傷：呈淡黃色或者黃綠色，質地較均勻；細胞球狀或近球狀，細胞核大，細胞質濃

非胚性愈傷：呈褐色、白色粉末狀或白色、綠色堅硬塊狀 ；細胞一般爲長柱狀等非規則形狀，細胞核小，細胞質較稀 。

農桿菌介導轉基因的原理：植物細胞在受傷後，創傷分子誘導農桿菌Vir區各種基因的激活和表達，導致T-DNA被剪切，加工，形成T-鏈蛋白複合體（T-複合體），通過農桿菌和植物細胞的細胞膜，細胞壁進入植胞內，T-複合體上的核靶向序列可引導T-DNA整合到植物基因組。

三、材料與用品

1、實驗材料：棉花材料YZ1（上週做的無菌苗）、農桿菌菌株LBA4404。

2、用具： 超淨工作臺， 顯微鏡，載玻片，天平，三角瓶，封口膜，橡皮筋，鑷子，酒精燈，培養皿，濾紙，剪刀，醫用手術刀，搖牀。

3、藥品：誘導、共培養培養基，卡寶品紅染色液，MGL活化培養基，LB培養基，乙酰丁香酮（AS）。

四、實驗步驟

（一）棉花愈傷組織的誘導及觀察

1、愈傷誘導培養基的配製（第1周已做）

2、無菌苗的製備

3、無菌苗的切取：選取培養7天左右健壯的無菌苗?於墊有濾紙的培養皿上，用解剖刀切掉子葉及生長點，切掉胚根及相連的約1/4的下胚軸，餘下的下胚軸用作愈傷組織誘導的外植體，用解剖刀將下胚軸切成～0.7cm小段。

4、外植體接種及離體培養：將切離好的外植體接種於愈傷誘導培養基上（每瓶約7段），平行放?，28℃光照培養，每天14小時光照，進行愈傷組織誘導及增殖培養。

5、愈傷組織繼代（一個月後）：待培養一個月左右，將增殖後的愈傷組織連同下胚軸切斷繼代到分化培養基上，進行胚性愈傷組織的分化。

6、愈傷組織形態觀察：分別挑取少量非胚性愈傷和胚性愈傷組織，?於載玻片上，滴幾滴清水用鑷子搗碎愈傷組織，然後滴加一滴卡寶品紅染色數秒鐘後，在顯微鏡下觀察比較兩者細胞學特徵。

（二）農桿菌介導的棉花下胚軸的遺傳轉化

1、共培養及選擇培培養基的配製（第2周已做，沒倒皿的組倒皿）

2、無菌苗的製備（第2周已做）

3、農桿菌的活化（研究生幫忙做）：從超低溫冰箱內取出保存菌株的甘油管在冰上融化；按1:100的體積加入20ml LB液體培養基裏搖菌，28℃暗培養36-48hr；將渾濁的農桿菌液塗布於LB平皿上，28℃暗培養36-48hr；把培養基表面菌落刮入裝有20ml MGL培養基的三角瓶中（按1/1000比例加入AS），28℃、200rpm搖30min；OD值在0.5-1.5之間（估計）即可用於侵染。

4、下胚軸與農桿菌共培養：把無菌苗切成~7mm莖段（同誘導程序），用鑷子夾到經活化的菌液中進行侵染，搖勻，侵染10分鐘；倒掉菌液，將下胚軸轉入裝有濾紙的滅菌培養皿中，吹5分鐘使表面稍爲乾燥；再將下胚軸分散佈於墊有濾紙的共培養培養基中，19-21℃, 暗培養48-60小時結束共培養。

5、選擇培養（48-60小時後）：把經過共培養的下胚軸用鑷子轉入選擇培養基中，培養30天左右繼代一次轉入相同的選擇培養基中。

五、注意事項

1、在切無菌苗時，一定要使用鋒利的刀片,儘量做到一刀能切斷，避免擠壓莖段。

2、無菌苗培養時間不宜過長（培養七天最好）。

3、從超低溫冰箱內取出的甘油管，應儘量減少其在冰箱外的時間，用完後儘快放回冰箱。

4、侵染時下胚軸稍爲乾燥可以增加農桿菌的吸附。

5、共培養後第一次進行選擇培養時應儘量使培養的環境保持乾燥，可以減少農桿菌的污染。

6、整個過程均爲無菌操作環境。

六、實驗結果：

1．錐形瓶與平皿中的下胚軸生長狀況均良好，觀察到平皿中農桿菌介導轉化的下胚軸有發黑的現象，而錐形瓶中誘導的愈傷組織則無發黑現象。

2．兩個平皿中的擬南芥均生長緩慢且幼葉發黃，推測原因可能與雜菌感染有關。

篇三：生物技術製藥綜合實驗報告

生物技術製藥實驗報告

人表皮生長因子（hEGF）在大腸桿菌中的

表達與純

第一節引言

1.1表皮生長因子(EGF)概述

生長因子在人體中的信號傳導部分起着關鍵的作用，它可通過與細胞表面的蛋白質受體結合，參與細胞的各種生命活動。生長因子可以是維生素，鹼基，多肽等。所研究的表皮生長因子，就是一種人機體細胞合成的一種多肽。在生物體內，每個細胞的生長狀態不同，在不同組織中的細胞的表皮生長因子參與生長、增值、死亡等過程。

目前，表皮生長因子已得到廣泛應用。在許多公司已經開始研發甚至是生產出EGF，多種疾病的誘發原因很多，我們可以用EGF來進行詳細的診斷。之後致病的查出原因，給病人減少心理的壓力，帶來一線生機。在經過強烈的光刺激後，尤其是激光，人們的眼部會有很大的損傷，最嚴重的就是眼角膜損傷，無法修復。人體在經過紫外線的照射下皮膚的損傷以及高溫、蒸氣、火等造成的皮膚大面積與原來的不一樣的皮膚。對於這些傷害，我們可使用含有可促進人體表皮細胞的新陳代謝EGF的藥膏或者是化妝品，使皮膚變得如初。

在最早研究表皮生長因子的時候就只是證明是多肽，還沒有命名。是由Cohen在1960年，在提取神經生長因子時，意外發現除此種物質以外的一種多肽[2]。多個科學家對其充滿好奇心，在之後的十年內，Savage真正的研究清楚，命名此種多肽爲表皮生長因子。

1.2 表皮生長因子(EGF)的結構與性質

不同的生物中，表皮生長因子的蛋白一級結構不同。研究表明家族成員一般在多於50個氨基酸，而少於80個氨基酸，與我們所熟悉的胰島素一樣，表皮生長因子是由前體加工成的成熟的多肽，在具有生物活性[4]。如人體中的表皮生長因子是由53個氨基酸組成。

整個hEGF分子由兩個結構域組成。殘基1～33，形成N一端結構域；34～53爲C一端結構域；成熟hEGF的序列位於單鏈多肽的C一末端附近，由53個氨基酸殘基組成，並且其C一端和N一端分別由Arg／Asp ／Arg／His鄰接，故

成熟的EGF分子，可以經專一性Arg內肽酶的作用，從前體釋放[6]。二級結構上存在着反平行β片層結構是EGF骨架的常見結構，N一端和C一端在整個三維結構中不會發生什麼變動，維持此結構的是由三個二硫鍵[7]（由於6個半胱氨酸的存在），因此分子在一定的條件下生物活性表現“頑強”[8]。我們知道同一種酶在不同的生物中有不同的生物效應，同時不同的酶在不同的生物中會有相同的生物效應，hEGF也會有此種現象。hEGF-β和hEGF-γ是hEGF的兩種形式，在分子結構和同源性中相似度高，在蛋白中一級結構中即使是在C末端的某個位置上僅僅只有一個Arg的差別，當它們作用於不同細胞中的同一個受體，在生物體中的作用是一樣的[9]。

與許多古細菌中的酶一樣如生活在溫泉中古細菌，人體表皮生長因子在100℃煮沸達到30 min，仍然能保持結構、活性等穩定性；許多蛋白質在具有強列的催化效率的酶如胰蛋白酶作用下肽鏈被斷掉，而表皮生長因子耐它的消化。EGF在狹小的活性微環境中，由於常見的丙氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸[11]會提供作用基團，表皮生長因子才能與受體結合反應。多肽具有N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，據研究表明，表皮生長因子結構的兩端在細胞的生長中都很重要。

1.3 EGF的生物學效應及應用

細胞通過在信號傳導的過程中有多種方式包括直接或間接的接觸。自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物體內它亦可以與其他的因子結合作用於細胞。EGF生物效應很多，如下所述：

1.來源於人體的不同種組織的上皮細胞爲了適應人體的需要，從基因上賦予它很高分裂效率。EGF在其中起着關鍵性的作用。首先人體的皮膚表層會產生脫皮現象，證明有大量的細胞死亡。同樣，皮膚的表面受到傷害在癒合的過程會結痂，新的皮膚又長出來了。EGF在創傷修復中起着功不可沒的作用，在肝臟、腸道、角膜、胃等多種組織創傷的恢復的試驗研究[12]取得重大的突破，在臨牀上已經運用於燒傷、燙傷、創傷及外科手術傷口的癒合，使病人的痛苦少一點。