生物實驗常見問題

1、有關NaN3的問題：

A:我看到一篇用流式測細胞表面CD11b的論文，加入抗體後用含0.1%疊氮鈉的PBS懸浮細胞，然後上流式細胞儀檢測。我不太明白PBS中加入疊氮鈉起什麼作用。答：疊氮鈉是一種防腐劑，防止細菌增生，在這裏的目的是保護儀器。

注意，劇毒物。

B:在rna純化提取中洗脫液裏含有的“NaN3”是什麼作用?

答：提取後的RNA需要保存，需要加防腐劑，NaN3-疊氮鈉是比較合適的試劑，用萬分之五或千分之一就可以起到良好效果。

2、有關Elisa類問題：

A）爲什麼要選擇聚苯乙烯材料；

答：聚苯乙烯材料能吸附蛋白質。

B）我們一般用HIVHCV人IgG和HBsAg來包被，爲什麼選擇這幾種；

答：選擇什麼包被取決於你要檢測什麼，是抗原還是抗體。我們一般用HIVHCV人IgG包被來檢測HIVHCV的病毒抗原。用HBsAg包被，來檢測抗HBsAg抗體。

C）配置的時候用CB和抗原按比例配，CB起到什麼作用，最重要的作用是什麼

答：CB是碳酸鹽緩衝液吧，在pH9.6的碳酸鹽緩衝液中，蛋白質能吸附在聚苯乙烯表面。

D）洗去包被液的時候需要封閉，只要起到什麼作用；

答：封閉的'作用是封閉非特異性結合位點；防止抗原或抗體的非特異性吸附。

E）封閉後做實驗的時候家的是相對的抗體嗎？是什麼方法？夾心法還是什麼方法？我知道部是競爭法呵呵；

答：封閉後加的東西取決於試驗方法；間接法一般是抗體，雙抗夾心法一般是抗原。F.)CB包被液配置爲什麼選用這幾種試劑（Na2CO3NaHCO3NaN3）；封閉液起到什麼作用？包被的是抗原吧？

答：Na2CO3NaHCO3是配製碳酸鹽緩衝液的一對緩衝試劑，NaN3是防腐作用。

封閉液的作用是封閉非特性吸附位點。一般含有動物血清或BSA.包被即可能是抗原也可能是抗體，看你要測什麼，選什麼方法。

3、有關細胞免疫熒光

A、步驟：

1、固定：PBS5min×3次振盪洗滌製作好的細胞爬片。固定液覆蓋細胞，RT靜置15min。PBS5min×3次振盪洗滌。

2、通透化：通透液覆蓋細胞，RT靜置30min。PBS5min×3次振盪洗滌。

3、封閉：封閉液覆蓋標本表面37℃孵育1h。

4、一抗孵育：一抗以合適濃度稀釋PBS，覆蓋標本表面。4℃孵育過夜，第二天37℃復溫1h。PBS5min×3次振盪洗滌。

5、二抗孵育：FITC標記二抗以合適濃度稀釋於PBS，覆蓋標本表面。37℃避光孵育<60min。PBS5min×3次避光振盪洗滌。

6、染核：新鮮稀釋Hoechst覆蓋細胞表面，RT避光靜置<10min。PBS5min×3次避光振盪洗滌。

7、封片：在乾淨的載玻片上滴一滴封片劑，將爬片的細胞面扣在封片劑上。

8、鏡檢，4℃避光保存。

注：1、細胞密度要合適，狀態較好。2、從孵育二抗開始要避光（關閉室內日光燈

即可）。