分子生物學實驗講義示例
CTAB法提取植物基因組DNA
【實驗背景】
高等動物,高等植物的基因組相當龐大,一些物種的特定基因組包括了該物種生長,發育,繁殖等各項生理活動的幾乎全部資訊量,因而對真核細胞基因組的結構,組成,以及表達調控的研究是至關重要的,而提取要求是獲得純度高和收得率高。
【實驗目的】
1、掌握植物材料基因組DNA的CTAB法提取分離基本原理的方法;
2、掌握微量移液槍、液氮研磨、微量試管、高速離心機等使用操作技術。
【實驗原理】
植物組織採用液氮研磨達到細胞破碎,細胞內容物採用CTAB分離蛋白質、多糖,再有苯酚、氯仿、異戊醇混合液萃取純化,RNA由RNA酶消化,分離出的DNA由無水乙醇沉澱分離
【材料儀器】
材料:幼嫩的植物材料1.0g左右(紅葉石楠)
儀器:移液槍、電子天平、恆溫水浴箱、高速離心機、EP管、液氮、研磨等。
【實驗試劑】
抽提緩衝液(2×CTAB溶液):2%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、20mmol/LEDTA、1.4mol/L NaCL、1%β-巰基乙醇、
0.1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、100mmol/L Tris-HCl(pH=8.0) TE: 10Mm Tris-HCl(pH=8.0),1mM EDTA
其他試劑:液氮、RNA酶、氯仿、異戊醇、CTAB、無水乙醇、苯酚、EDTA等
【實驗操作】
取1.0g植物材料,雙蒸水洗淨,並用濾紙吸乾 植物材料剪成0.5cm左右碎片,放入預冷的瓷研磨中。 加入液氮速冷,研磨成細粉(越細越好)。
轉入加有抽提緩衝液3.0ml的5ml離心管
60℃水浴保溫1小時(不時轉動試管)
分裝成2個管,15,000 rpm,離心10分鐘
取上清轉入另一個新的離心管,加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),混合均勻抽提至水乳膠融狀。
15,000 rpm離心5分鐘
上清液轉移到另一離心管中,加入0.8-1.0倍體積預冷異戊醇 ,-20℃保溫30分鐘-1小時,緩緩混勻DNA成絮狀折出
15,000 rpm,離心5分鐘,棄上清
DNA沉澱用冰冷的70%乙醇洗2次
揮發盡乙醇後,用200μl TE緩衝液溶解DNA,-20℃凍存。
【注意事項】
1、使用新鮮、幼嫩的'材料,材料應適量。
2、如果樣品容易呈粘稠狀,可能含有較多的多糖。
3、如果樣品溶液呈棕色,可能含有較多的酚類物質。
4、操作過程中避免劇烈振盪,器件、器皿和試劑需要高溫滅菌。
【思考題】
1、為什麼要用新鮮、幼嫩的植物組織材料?
2、為什麼在操作過程中避免劇烈振盪?
3、為什麼器件、器皿和試劑需要高溫滅菌?
4、如何提高提取植物組織DNA的產量?
苯酚:作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由於蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶於酚相,而DNA溶於水相。
氯仿:也可使蛋白質變性並加速有機相與液相分層。
異戊醇:有助於消除抽提過程中產生的氣泡。
CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽離子去汙劑,具有從低離子強度溶液中沉澱核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質和多聚糖形成複合物,只是不能沉澱核酸。通過有機溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等雜質後加入乙醇沉澱即可使核酸分離出來
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